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一．相關定義
抗體：機體在抗原物質刺激下，由B細胞分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發生特異性結合反應的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文縮寫為Ig.
抗原：指能夠刺激機體產生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體外結合，發生免疫效應（特異性反應）的物質。簡單的說抗原就是一種特定的外來物質。
抗原表位：結構已經確定了的抗原決定簇（即能與特異性抗體結合的區域）。
抗體的效價：指抗體的物理狀態及其在體內的滯留時間，以其與抗原反應的多少來表示其免疫效果。

二．抗原的偶聯（半抗原的偶聯）因為半抗原一般只有反應原性，沒有免疫原性，注入機體后易被機體所吸收。一般而言，半抗原連接一定的蛋白載體（BSA, KLH, OVA, HAS等等）就有比較好的免疫原性了，不同的物質有不同的偶聯方法。這個可以查看相關資料。

三．動物的免疫
1.一般用年輕健康的新西蘭大白兔作為免疫的對象，大小為4到5斤。
2.兔的免疫劑量為200ug-1mg/次，以后每次適當減少，加強免疫的量為首次的1/5-2/5.
3.初次免疫一般將抗原與佛式完全佐劑（由羊毛脂，石蠟油，卡介苗組成，卡介苗起免疫應答的作用。）等體積混合，后續免疫用佛式不完全佐劑等體積混合，一般采取皮下注射免疫周期一般為70天。具體免疫時間如下：
免疫次數        免疫時間    
初次免疫        第1天    
第二次免疫        第20天    
第三次免疫        第40天    
第四次免疫        第60天    

4.最后一次免疫完成10天以后，就可以進行終放了。其中在第三次免疫完成以后的第10天即在第50天的時候靜脈取血檢測抗體的效價。
四．抗體效價的檢測（一般用ELISA間接法進行檢測）
1）2個參照:陰性參照為預取血血清，均以1抗起始濃度稀釋;陽性參照為以前陽性血清或者細胞上清
2）于96空板中每孔適量的抗原，邊沿孔應盡量避免使用，會降低細光值,影響結果。于4℃過夜，緊急情況也可以37℃孵育2小時。
3）倒掉抗原，每孔加入200ul的封閉液，4℃過夜或者37℃孵育2小時。
4）倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時間,盡量風干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5）取包好的96孔板，第一孔加入陰性參照液50ul，第二孔加入陽性參照液50ul，第三孔加入稀釋的抗體（1：500=抗體：封閉稀釋液），后面的第四孔到第12孔加入50ul的封閉稀釋液，然后取50ul稀釋的抗體進行梯度稀釋，第12孔取出50ul的液體，保證每孔液體為50ul。再于37℃孵育1 小時。
6）倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP標記的2抗（1：2000），于37℃孵育45分鐘。
7）倒掉液體，有洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（A+B等體積配置，現配現用）溫室孵育5—20分鐘(根據顏色的改變速度)。
8）每孔加入100ul的終止液（0.M草酸），在酶標儀上讀取450nm的吸光度。
五．抗體的純化。（一般用親和純化，這種方法得到的抗體的純度高一些。）
(1) 親和柱的制備
1）稱取0.3mg溴化QING活化的瓊脂糖凝膠加入1mmol／L的鹽酸中，4`C過夜使其充分溶漲，可獲得1ml溶漲膠。
2）將凝膠轉移入純化柱中，用約30ml 1mmol／L的鹽酸洗介質3次。
3）用偶聯緩沖液洗介質一次，因為活化基團在偶聯緩沖液PH值下易水解，所以此步驟最好在幾分鐘內完成。
4）將溶解在5ml偶聯緩沖液中的10-60nmol的配體加入凝膠中，如需測定結合效率一定要取少量陪體溶液待測。
5）溫室下輕輕混合搖動2小時，或4`C過夜，如需測定結合效率此步驟結束后取少量溶液待測。
6）用30ml的偶聯緩沖液洗介質一次。
7）加入15ml阻斷緩沖液溫室孵育2小時或4`C過夜。
8）依次用20ml的偶聯緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液洗介質一次。重復4次步驟8。
9）重復4次步驟8。
10）配體固相化完成，可用于純化。
11）若不立即使用，用20%的乙醇封存。
（2）抗體的純化
1）原血清用PBS等體積稀釋，混勻1min，5000-10000r／min，4-20離心15分鐘，取上清，并留樣送檢。
2）用層析儀或手工，10倍體積的PBS 2-4ml／min流速清洗平衡柱子。
3）稀釋離心完的上清樣品，0.5-1ml／min流速上樣。
4）上樣完后，用15倍體積的PBS2-4ml／min流速清洗平衡柱子，洗去柱子上殘留的雜蛋白。
5）用5-10倍體積的Anitibody Elute Buffer C 洗脫結合在親和柱子上的抗體，分管收集，沒管收集1ml并預先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D調PH至中性（PH7-7.5），如果有層析儀也可以根據層析儀紫外吸收峰檢測收集。
6）洗脫完畢后，柱子用5倍體積的PBS 2-4mi／min流速清洗平衡。
7）用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
（3）抗體的濃縮
1）一般收集濃度較高的幾管洗脫液，無須濃縮，若弄多實在太低（小于0.5mg／ml），則將收集的餾分加和起來。
2）轉移入15ml 的超濾管，3500r／min離心20分鐘左右（根據要濃縮的體積摸索離心時間），將濃縮好的抗體小心的用移液器取出來。
3）取700ul 濃縮的抗體檢測280nm的吸光度，讀數不要超過2，用吸光度讀數除以1.35，即為抗體的大致濃度?？贵w的濃度也可以用（OD280nm-0.35xOD495nm）1.4這個公式計算。濃縮的程度：使抗體的濃度在0.5-1mg／ml之間最好。最后通過濃度x體積計算抗體的總量。
（4）抗體的保存
抗體中添加40-50%甘油，可以短時間存放于4℃，如需以后使用，一般500ul／管凍存于-20℃或者更低溫度的冰箱中。
（5)抗體純度的鑒定
一般而言，我們在將抗體純化以后，如果想知道抗體的純度和濃度究竟怎么樣，就需要走個SDS-PAGE電泳。電泳的方法在網上到處都是，在此就不多說了。